--細 胞 基 本 信 息---

細胞名稱： LLC(小鼠肺癌細胞)

細胞別稱： LL/2 (LLC1); LL/2 (LLc1); LL/2(LLc1); LL/2; LL2; LLC1; LLC; Lewis lung carcinoma line 1; Lewis lung carcinoma; Lewis-Lung; Lewis Lung

細胞貨號： SNL-119

生長特性： 貼壁

培養條件： DMEM+10% FBS+1% P/S

培養環境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細胞簡介： LLC細胞是一種從C57BL小鼠的肺中建立的細胞系，該小鼠攜帶由原發性Lewis肝癌植入引起的腫瘤。LLC細胞對1, 3-雙-（2-氯乙基）-1-亞硝ji脲有抗性，但對甲氨蝶呤敏感。據報道，LLC細胞具有高度致瘤性，可以在C57BL小鼠成瘤，但在小鼠中轉移性較弱。LLC細胞在培養瓶中形成多層，但實際上沒有融合。LLC細胞鼠痘病毒陰性，被廣泛用作轉移模型，并有助于研究癌癥化療藥物的機制。

細胞正常生長形態照片

LLC細胞培養注意事項：

1. 形態多樣

LLC細胞形態不均一，上皮樣細胞與圓形細胞同時存在，比例不定，兩種形態的細胞皆為貼壁狀態?？赡艽嬖谏倭科〖毎?，當貼壁細胞較多時，漂浮細胞可以舍棄。當漂浮細胞較多時，可在換液時離心收集并接種回原瓶。

2. 細胞生長較快

培養時應加入足量的培養基，避免培養基營養快速耗盡導致細胞脫落或狀態變差。注意關注培養基顏色變化和細胞密度，培養基變黃后及時換液，細胞密度到達80%后及時傳代。

3. 密度較高時易堆疊生長

注意控制細胞密度不要過高，長期高密度培養易導致細胞堆疊生長或細胞聚團。

4. 對血清要求高

LLC細胞對血清質量較為敏感，需要使用高質量胎牛血清進行培養。若培養中途更換血清品牌，細胞需要經歷一個過渡期。（若需更換血清品牌，建議先使用廠家配套的完quan培養基進行培養并保種，再更換新品牌血清配制的培養基進行測試培養，避免細胞因不適應新血清而損失細胞）

5. 細胞貼壁較弱

該細胞貼壁比較弱，消化時間偏短，注意控制消化時間（消化步驟見下文傳代攻略）

。

另外，在遇到快遞運輸震蕩、低溫、室溫靜置太長時間、添加的培養基或其他試劑過冷等情況時會出現明顯的細胞回縮變粗變短甚至脫落的現象，及時放回培養箱靜置培養后可恢復正常。

平時注意傳代換液前將培養基、PBS等試劑充分預熱，不要把細胞放在室溫下太長時間。采用T25瓶發貨，收貨時可能出現部分細胞漂浮，正確處理后細胞可正常生長（處理方法見下文收貨攻略）

LLC細胞傳代攻略

1. 準備所需的培養基、胰酶、PBS、離心管、培養瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預熱）

2. 先盡量吸干凈T25瓶原培養基，再加5mL 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；

3. T25瓶加1mL胰酶，輕輕晃動培養瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養瓶放入37度培養箱消化；

4. 消化到細胞明顯回縮，間隙變大，但未完quan脫落時加2-3mL完quan培養基終止胰酶消化；

Tips：

如果您無法準確掌控胰酶作用時間，建議按照下述操作：加入胰酶后，放入37度培養箱消化，然后每隔30秒拿出觀察，若細胞部分滑落，說明消化完成可以終止消化，否則再放回培養箱消化30秒重復操作；細胞貼壁較弱，所以消化時間會比常規貼壁細胞短很多，注意控制消化時間；

5. 混勻細胞并轉移至離心管中，1000rpm離心3min；

6. 在新的培養瓶中加入適量新鮮培養基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

7. 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養基輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養箱中繼續培養，注意培養瓶蓋透氣；

Tips：

1. 推薦傳代比例1：2，細胞生長至80%密度時立即傳代。

2. 建議傳代后24h觀察細胞，若有漂浮死細胞，可通過換液去除（換液前培養基預熱）

LLC細胞凍存攻略

1. 配制程序性凍存液，準備相應數量凍存管并做好標記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養基+8%DMSO

2. 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀；

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至凍存管中；

4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

5. 轉移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置。

Tips：

l 液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存。

l 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請按產品說明書處理降溫過程。

l T25培養瓶長滿通常可凍存2-3管，10cm皿長滿通?？蓛龃?-4管。

l 凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態不佳。

LLC細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；

2. 將細胞從液氮罐中取出，觀察管內無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

l 若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

l 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內是否存在液氮，若有液氮需靜置一會待液氮完quan蒸發后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開導致受傷。

l 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉速會有差異

4. 離心完成后棄上清，用預熱的培養基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養瓶中，輕輕混勻后放入培養箱；

5. 復蘇24小時后觀察細胞貼壁情況。

Tips：整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內完成。

LLC細胞收貨攻略

l 常溫細胞

1. 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養箱靜置4h以上；

2. 吸走大部分培養基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首ci傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續培養至細胞密度80%以上再進行傳代培養；

Tips：若收貨時細胞發生脫落漂浮，請按以下步驟處理：

1. 先放培養箱靜置4h，所有培養基（1200rpm，5min）離心收集漂浮細胞。

2. 離心完，上清轉移至新的離心管后續可用于培養細胞。用1mL 0.25%胰酶（含EDTA）輕輕吹起細胞沉淀（不要反復吹打），室溫靜置30s后加3mL完培中和胰酶，離心去上清，用新鮮完培重懸混勻細胞。

3. 同時，貼壁細胞用預熱的PBS輕輕潤洗后加1mL胰酶（勿沖洗），放37度培養箱消化1min，加3mL完培中和胰酶，離心去上清，用新鮮完培重懸混勻細胞。

4.  第2、3步收集的細胞合并起來，均勻接種到2個新的T25培養瓶(或6cm皿)中。24h后觀察細胞狀態。

l 凍存細胞

1. 細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完quan揮發建議立即復蘇細胞并聯系銷售人員解決；

2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3. 復蘇一管細胞出現異常及時聯系銷售人員，在專業技術支持的指導下進行下一步操作；

Tips：

1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰完quan揮發等異常情況時，及時拍照聯系銷售人員；

2. 尚恩生物T25瓶發貨的細胞內含對應細胞的完quan培養基，可以收集原裝培養瓶內培養基經1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

常見問題及解決方案

細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實際培養過程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現細胞狀態的一種方式；

NO.2培養過程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可通過換液去除，因此每2天正常換液即可，換液前培養基充分預熱。

NO.3細胞具體消化時間是多久？

每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完quan規定消化時間，以實際消化效果和客戶經驗為準。 

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