細(xì)胞基本信息
細(xì)胞正常生長(zhǎng)形態(tài)照片
細(xì)胞名稱:SK-BR-3(人乳腺腺癌細(xì)胞)
細(xì)胞別稱 :SK-Br-3; Sk-Br-3; SK BR 03; SKBR-3; SKBr-3; SK-BR3; SKBr3; SkBr3; SKBR3
細(xì)胞貨號(hào): SNL-058
生長(zhǎng)特性 :貼壁
培養(yǎng)條件 :1640+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境 :空氣,95%;二氧化碳 (CO2),5%;37℃
細(xì)胞簡(jiǎn)介: SK-BR-3細(xì)胞是由Trempe·G和Old·L·J于1970年從一位曾接受過放射、類固醇、環(huán)磷酰胺和5-氟尿嘧啶治療的43歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離得到的。SK-BR-3細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)特征包括微絲和橋粒、肝糖原顆粒、大溶酶體、成束的細(xì)胞質(zhì)纖絲;SK-BR-3細(xì)胞過表達(dá)HER2/c-erb-2基因產(chǎn)物,不含病毒顆粒。SK-BR-3細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和乳腺癌研究,也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)
1、形態(tài)多樣
SK-BR-3細(xì)胞形態(tài)不均一,以鋪路石樣細(xì)胞為主,同時(shí)存在部分圓形細(xì)胞,兩種形態(tài)的細(xì)胞皆為貼壁狀態(tài)。
2. 生長(zhǎng)較慢
SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢,在1:2傳代的條件下需要培養(yǎng)4-7天可達(dá)到80%密度。請(qǐng)勿頻繁換液和消化,減少觀察頻率,保證細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境穩(wěn)定。若細(xì)胞生長(zhǎng)過慢,可以采用半換液的方式進(jìn)行換液(詳細(xì)步驟見下圖),促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。
▲半換液操作示意圖
3. 存在漂浮細(xì)胞
SK-BR-3在培養(yǎng)時(shí)存在漂浮細(xì)胞,特別是傳代和復(fù)蘇后,因部分細(xì)胞貼壁較慢,可能存在較多的漂浮細(xì)胞。因此,在傳代和復(fù)蘇后的48小時(shí)內(nèi),不建議對(duì)細(xì)胞進(jìn)行任何操作,使細(xì)胞保持靜置狀態(tài),促進(jìn)細(xì)胞更好地貼壁。
若細(xì)胞長(zhǎng)期存在大量的漂浮細(xì)胞,請(qǐng)使用臺(tái)盼藍(lán)染液檢測(cè)漂浮細(xì)胞活性。如果大部分是死細(xì)胞,需及時(shí)換液清除;如果大部分是活細(xì)胞,在換液時(shí)離心收集,并放回原瓶。
SK-BR-3細(xì)胞傳代方法
1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等;(試劑提前預(yù)熱)
2. 抽走培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基,加5mL PBS潤(rùn)洗1-2遍,清除殘留培養(yǎng)基;3. 盡量吸干潤(rùn)洗的PBS后加1mL胰酶,搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底,放置培養(yǎng)箱37℃消化;
4. 消化時(shí)每隔30s拿出來觀察,鏡下可見細(xì)胞明顯回縮,輕拍培養(yǎng)瓶部分細(xì)胞開始脫落時(shí)立即加入3-4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化,吹落貼壁的細(xì)胞;
Tips:注意控制吹打力度輕柔,吹打次數(shù)不可過多,避免機(jī)械損傷
5. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,1000rpm,3min離心收集細(xì)胞;
6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)
7. 離心完成后,棄上清,加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞,將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,十字法或8字法混勻,然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),注意培養(yǎng)瓶蓋透氣;
Tips:
1. 推薦傳代比例1:2,細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度時(shí)傳代,密度過大時(shí)易出現(xiàn)漂浮細(xì)胞。
2. 該細(xì)胞傳代后貼壁較慢,傳代后48小時(shí)內(nèi)不應(yīng)擾動(dòng)細(xì)胞。
SK-BR-3細(xì)胞凍存方法
1. 配制程序性凍存液,準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量?jī)龃婀懿⒆龊脴?biāo)記。
Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO
2. 先將細(xì)胞按傳代步驟消化、離心、棄上清,獲得細(xì)胞沉淀;
3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中;
4. 將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過夜;
5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置
Tips:
液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性,若活性合格即可長(zhǎng)期保存。
程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液請(qǐng)按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。
T25培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿通常可凍存2-3管,10cm皿長(zhǎng)滿通常可凍存3-4管。
凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。
SK-BR-3細(xì)胞復(fù)蘇方法
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;
2. 將細(xì)胞從液氮罐取中出,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,捏住管蓋,將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴,融化過程不超過2min;
Tips:
若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。
凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過程中難免滲入液氮,取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮需靜置一會(huì)待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù),避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。
水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。
3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異
4. 離心完成后棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;
5. 復(fù)蘇24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況。
Tips:
1. 整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
2. 該細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁較慢,復(fù)蘇后48小時(shí)內(nèi)不應(yīng)擾動(dòng)細(xì)胞。
SK-BR-3細(xì)胞收貨攻略
?常溫細(xì)胞
1. 收貨后,拆開外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上;
2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,觀察細(xì)胞密度,若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代(首*傳代比例建議1:2),若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng);
Tips:若收貨時(shí)發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞較多,應(yīng)離心收集懸浮細(xì)胞并放回原瓶
?凍存細(xì)胞
1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查,若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長(zhǎng)期保存,若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決;
2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;
3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作;
Tips:
1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時(shí),及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員;
2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng);
常見問題及解決方案
細(xì)胞密度怎么計(jì)算的?
嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量,但在實(shí)際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤(rùn)洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化,混勻細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞,再離心后,用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時(shí)碎片比較少,傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。
NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久?
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的,不能完*規(guī)定消化時(shí)間,以實(shí)際消化效果和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。
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